Projekty

Projekty

V naší laboratoři se v rámci vědeckých projektů zabýváme těmito tématy: 

 


Projekty zaměřené na studium leukémií:

 

Delece genu ERG u ALL

Intragenové delece v genu ERG jsou jednou z rekurentních aberací dětských ALL. Vyskytují se především u podskupiny dětských ALL definovaných specifickým expresním profilem a dále u ALL vycházejících se prekursorů B řady, u kterých dochází během indukční léčby k přesmyku do myeloidní linie. Přítomnost ERG delecí neutralizuje nepříznivý prognostický význam jiných faktorů, se kterými se často pojí, jako jsou delece genu IKZF1 či vyšší věk v době diagnózy ALL (Zaliova et al., Leukemia 2014). Cílem projektu je charakterizace původu delecí genu ERG a šíře jejich repertoáru a poodhalení jejich biologické role u dětských ALL. 

Kontakt: marketa.zaliova@lfmotol.cuni.cz

 

 

Využití NGS a SNParrays v klasifikaci dětských ALL a v identifikaci léčebných cílů a nových aberací 

Se zavedením moderních „high-throughput“ metod, jako jsou SNParrays s velkým rozlišením a sekvenování nové generace (především sekvenování celého exomu a transkriptomu: WES a RNAseq), došlo v posledních letech k posunu v klasifikaci dětských ALL a rozšíření panelu známých rekurentně se vyskytujících aberací a to primárních i sekundárních. Kromě toho, že se dozvídáme stále více o genetickém pozadí a tedy i biologii ALL, nacházíme mezi novými aberacemi také nové prognostické faktory a cíle specifické léčby. Zároveň se ukazuje, že u části pacientů se vyskytují dosud nepopsané a nerekurentní genetické aberace (tedy tzv. privátní aberace), které není možné identifikovat jinak, než právě za pomoci výše zmíněných necílených extensivních metod. Cílem projektu je za pomocí uvedených metod charakterizovat a re-klasifikovat tzv. B-other ALL (zjednodušeně B-prekurzorových ALL, u nichž nedojde ke genetickému zařazení v rámci rutinní diagnostiky) a identifikovat potenciální léčebné cíle u rezistentních ALL. V navazujících in vitro studiích se zabýváme onkogenním potenciálem nově identifikovaných aberací a jejich vlivem na buněčnou signalizaci. 

Kontakt: marketa.zaliova@lfmotol.cuni.cz

 

 

Leukémie s fúzním genem TEL/ABL 

Fúzní gen TEL/ABL se u leukémií vyskytuje vzácně (Zuna & Zaliova et al., Genes Chromosomes & Cancer, 2010), jeho nalezení má však zásadní význam v léčbě pacientů, jelikož představuje cíl specifických léčiv - inhibitorů tyrozinových kináz (TKI). Cílem projektu je charakterizace těchto leukémií na klinické (frekvence, prezentace a prognóza onemocnění, postavení TKI v léčbě) i molekulárně biologické úrovni (expresní a genomický profil) a dále studium možných mechanismů rezistence k TKI. 

Kontakt: marketa.zaliova@lfmotol.cuni.cz

 

 

Monitorování minimální reziduální nemoci u dětských AML

Zatímco na poli dětských ALL je monitorování minimální reziduální nemoci (MRN) již řadu let součástí moderních léčebných protokolů, kde představuje nenahraditelný nástroj ke stanovení rizikovosti a řízení intenzity léčby, využitelnost monitorování MRN u dětských AML nebyla dosud jednoznačně ustanovena. Cílem této pětileté observační studie je vyhodnotit praktickou použitelnost (úspěšnost identifikace specifického cíle, úspěšnost zavedení dostatečně citlivého detekčního systému) monitorování MRN, posoudit využitelnost periferní krve namísto kostní dřeně a nalézt optimální časové schéma monitorování MRN tak, aby se mohlo stát standardní součástí příštích léčebných protokolů. 

Kontakt: marketa.zaliova@lfmotol.cuni.cz

 

 

Role Homeoboxových genů v leukemogenezi

Homeoboxové geny hrají klíčovou roli v embryogenezi a organogenezi. Předpokládá se jejich role také v nádorovém bujení, hlavně při vzniku leukemií, vzhledem k popsané aberantní expresi. Cílem projektu je studovat mechanizmus, který je zodpovědný za dysregulaci HOX genů. Rozhodli jsme se studovat tři mechanizmy: DNA metylaci, která reguluje transkripci HOX genů během embryonálního vývoje; mutace v core promotoru HOX genů a alternativní signalizace způsobená mutacemi tyrozin kináz. 

Kontakt: julia.starkova@lfmotol.cuni.cz

 

 

Predikce rezistence leukemických buněk k L-Asparagináze 

Akutní lymfoblastická leukémie, nejčastější maligní onemocnění u dětí, je léčena kombinovanou chemoterapií, která zahrnuje enzym L-Asparaginázu (L-Asp). Cytotoxický efekt L-Asp spočívá ve schopnosti depletovat extracelulární asparagin a glutamin, na což jsou leukemické buňky velmi citlivé pravděpodobně kvůli snížené aktivitě glutamin-dependentního enzymu asparagin syntetázy (ASNS). Ačkoliv bylo se vznikem rezistence na L-Asp spojováno zvýšení hladiny ASNS v leukemických blastech, nejnovější práce tuto hypotézu nepotvrdily. Hlavním cílem našeho projektu je identifikovat geny související s mechanizmem účinku L-Asparaginázy v leukemických buňkách a odhalit dráhy, které se účastní vzniku rezistence.

Kontakt: julia.starkova@lfmotol.cuni.cz

 

Původ dětských leukemií 

Cílem projektu je podrobná analysa preleukemických buněk, které pro tyto účely budou získávány čtyřmi různými přístupy. Kombinace všech čtyř zdrojů by měla umožnit molekulárně-genetickou, cytogenetickou a funkční charakterisaci preleukemických buněk a objasnění alespoň některých mechanismů, které vedou k jejich přeměně v buňky plně leukemické. Kromě informací o původu, vzniku a vývoji leukemického klonu to může v důsledku přispět k úspěšnému ovlivnění procesu této přeměny i při hledání optimální léčebné strategie u již diagnostikovaných leukemií (neboť právě preleukemické buňky, které uniknou chemoterapii, jsou v některých případech zdrojem pozdější rekurence leukemie). 

Kontakt: jan.zuna@lfmotol.cuni.cz

 

Studium liniové plasticity leukemických buněk 

Některé starší modely krvetvorby předpokládaly, že prvním krokem ve vývoji hematopetických buněk je striktní oddělení lymfoidní a myeloidní linie. Podle nových poznatků se zdá, že liniová plasticita je větší a vývoj do lymfoidní resp. myeloidní linie může procházet stádii tzv. společných T/myelo a B/myelo progenitorů. Leukemické buňky mohou mít tento potenciál buď zesílený nebo jejich přímým nemaligním protějškem je buňka T/myelo, resp B/myelo progenitoru. Mezi dětskými pacienty s akutními leukémiemi jsme identifikovali podskupiny pacientů s leukémií smíšeného fenotypu (mixed phenotype acute leukemia, MPAL) T/myelo a leukemií s přesmykem linie („lineage-switch“) z B lymfoidní do myeloidní během indukční léčby. Studujeme společné genetické změny, vliv léků podávaných během indukční léčby. Pracujeme na myším modelu liniového přesmyku. 

Kontakt: ester.mejstrikova@lfmotol.cuni.cz

 

Standardizace 8-mi barevné cytometrické diagnostiky v hematologii 

Cytometrie je klíčovou metodou pro diagnostiku hematologických malignit. Metodická náročnost a komplexita diagnostických vyšetření dosud neumožňovala přímou porovnatelnost změřených dat mezi laboratořemi. CLIP – Cytometrie jako ustavující člen mezinárodního EuroFlow konsorcia (www.euroflow.org) je aktivní ve vývoji standardizovaných postupů, v designu panelů pro stanovení Minimální residuální nemoci a v současné době usiluje o zprostředkování know-how EuroFlow českých laboratořím.

Kontakt: tomas.kalina@lfmotol.cuni.cz

 

Diferenciační plasticita hematopoetických buněk

Po dlouhou dobu byla krvetvorba vnímána jako přísně regulovaný proces, v němž se postupně sužují možnosti vývoje jednotlivých buněčných řad a nakonec vzniknou diferencované buňky. V posledních letech se však objevují práce, které dokumentují vývoj myeloidních buněk z lymfoidních prekurzorů za určitých molekulárně definovaných okolností. U hematologických malignit se často setkáváme s aberantní expresí různých antigenů. Zdali tato promiskuita vychází z přirozeně se vyskytujících vývojových změn, není dosud jasné. Cílem tohoto projektu je objasnit vztah mezi promiskuitou maligních a plasticitou normálních hematopoetických buněk a popsat regulační dráhy vedoucí k liniové restrikci resp. k uvolnění z této restrikce.

Kontakt: ondrej.hrusak@lfmotol.cuni.cz

 

Afinitní „high-content“ proteomika: MAP (Microsphere-based affinity protomics) 

Projekt ve spolupráci s Rikshospitalet University Hospital, Oslo, Norsko (F. Lund-Johansen), který má za cíl vytvořit a validovat protilátkové „arrays“, které budou schopné odhalovat nové prognostické znaky dětských leukémií. Metoda používá diferencovanou detergenční lýzu pro oddělení subcelulárních kompartmentů lyzátů buněk, size-exclusion chromatografii pro rozlišení velikosti proteinů a průtokovou cytometrií pro rozlišení barevně kódovaných kuliček a detekci signálu. Umožňuje detekci až 1700 proteinů najednou a patří k tzv. "high-content" metodám. Zásadní problémem, který náš tým řeší je vytipování vhodných cílů, analýza primárních leukemických buněk při diagnóze a bioinformatické zpracování získaných dat. Projekt byl podpořen grantem z Islandu, Lichtenštejnska a Norska prostřednictvím Finančního mechanismu EHP a finančního mechanismu Norska. 

Kontakt: tomas.kalina@lfmotol.cuni.cz

 

 

Projekty zaměřené na studium poruch krvetvorby a imunitního systému:


Sekvenování nové generace pro analýzu přestaveb receptorů pro antigeny a jeho využití v hodnocení patologických stavů imunity 

Sekvenování nové generace (NGS) je novou metodou s výstupem statisíců až milionů přečtených sekvencí, která začíná být dostupná v běžné laboratorní praxi. NGS se nabízí jako ideální metoda pro určení spektra přestaveb genů pro imunoglobuliny (Ig) a T-buněčné receptory (TCR), která přinese komplexní informaci o zastoupení a kinetice lymfocytárních klonů s konkrétními sekvencemi receptorů pro antigeny. V projektu plánujeme tuto metodu validovat pro účely sledování minimální reziduální nemoci (MRN) u lymfoidních malignit s předpokladem, že NGS předčí stávající metodu kvantifikace konkrétního klonu ve všech aspektech, včetně finančního. Současně s MRN bude možno studovat obnovování repertoáru Ig a TCR po iniciální chemoterapii a po transplantaci hemopoetických progenitorů u dětské akutní lymfoblastické leukémie a kinetiku konkrétních populací nemaligních lymfocytů cílených proti infekcím, reziduálním leukemickým buňkám, případně vlastním antigenům v případě  reakce štěpu proti hostiteli.

Kontakt: eva.fronkova@lfmotol.cuni.cz

 

 

Dysregulace imunitního systému: vlastnosti lymfocytů u pacientů s immunodeficiencí a autoimunitními projevy

Defekty imunity se často vyznačují kombinací nedostatečné kontroly infekce a zároveň autoimunitními projevy způsobenými reakcí organismu proti vlastním antigenům. Patogenetickým podkladem mohu být poruchy ve funkci T a B lymfocytů a špatná regulace jejich vzájemné spolupráce. V navrhovaném projektu plánujeme pomocí nejmodernějších technik mnohobarevné průtokové cytometrie (MC-FACS) a molekulární genetiky podrobně charakterizovat složení, aberace a vzájemné systémové vztahy fyziologických i patologických subpopulací lymfocytů u všech primárních imunodeficitů (PID) diagnostikovaných na zúčastněných pracovištích v průběhu řešení projektu a u souboru pacientů s běžným variabilním imunodeficitem (CVID) a selektivním deficitem IgA. Na základě bioinformatické analýzy výsledků MC-FACS od přibližně 150 pacientů bude vypracováno v součinnosti s mezinárodní skupinou EuroFlow-PID diagnostické schéma pro jednotky s již známou genetickou příčinou a budou vytipovány skupiny pacientů s podobným laboratorním a klinickým obrazem k celogenomové analýze a validaci vytipovaných nových variací. 

Kontakt: tomas.kalina@lfmotol.cuni.cz

 

 

Imunopatologické mechanismy selhání kostní dřeně 

Kostní dřeň se svým mikroprostředím je specifický orgán, který je ovlivňován mnoha faktory. K jejímu selhání může docházet vlivem patologických stavů odehrávajících se přímo ve dřeni (například akutní leukémie), tak i faktory nepřímými, jako jsou například cytokiny produkované leukemickými i aktivovanými buňkami imunitního systému. U aplastické anémie byla prokázána úloha cytotoxických T lymfocytů, avšak obecně mechanismy vedoucí k selhání kostní dřeně nejsou zcela objasněny. Náš projekt je zaměřen na vrozená i získaná selhání kostní dřeně a za cíl si klade především identifikovat subpopulaci T lymfocytů, která se na selhání podílí. Tuto populaci chceme dále studovat z hlediska proliferační historie a cytokinového profilu, rovněž chceme i blíže studovat kmenové buňky krvetvorby v těchto změněných podmínkách. 

Kontakt: ester.mejstrikova@lfmotol.cuni.cz

 

 

Rekonstituce účinné CMV-specifické imunity

V tomto projektu sledujeme rekonstituci CMV-specifické imunity u dětských pacientů po transplantaci kmenových buněk krvetvorby. Pro detekci CMV-specifických subpopulací CD4+ a CD8+ T-buněk je užita metoda intracelulární detekce cytokinů založená na polychromatické průtokové cytometrii. Takto získaná data jsou porovnávána s hladinami virové nálože stanovené RQ-PCR a s klinickým průběhem CMV infekce v daných časových bodech. Na základě výsledků budou vytvořeny referenční hodnoty, jež poslouží pro vznik protokolu pro účinější zahájení preemptivní terapie a omezení nežádoucích vedlejších účinků.

Kontakt: tomas.kalina@lfmotol.cuni.cz

 

Projekty zaměřené na studium nádorových onemocnění:

 

Analýza interakcí nádorových buněk s mikroprostředím metodami hmotnostní cytometrie a proteinových arrays

Projekt vytvoří technologickou platformu pro výzkum komplexních tekutých tkání (periferní krev, kostní dřeň a CUSA aspirát) které jsou infiltrovány nádorovými buňkami. Přístup kombinuje dvě inovativní datově bohaté technologie: hmotnostní cytometrii („nádorová cytomika“), která zjišťuje změny v buněčném zastoupení infiltrovaných tkání a SEC-MAP array („proteomika“), která zjišťuje změny v proteomu nádorových buněk. Nejprve zmapujeme normální vývoj B-lymfocytů rezidentních v kostní dření, ke kterému bude možné vztahovat nádorem způsobené abnormity (potenciální biomarkery). Na modelu leukemických buněk a buněk mozkových nádorů dále určíme změny proteomu při maligním zvratu metodou SEC-MAP arrays. V další fázi budou biomarkery zabudované do panelů vyšetřovaných hmotnostní cytometrií („nádorová cytomika“). Vyvineme bioinformatické nástroje pro porozumění vzniklým vysoce kompexním datům.

Kontakt: tomas.kalina@lfmotol.cuni.cz