OPPK - CLIP: Hyperspektrální cytometrie

OPPK - CLIP: Hyperspektrální cytometrie

Reg.číslo: CZ.2.16/3.1.00/24505

 

 






Úvod

 

Hyperspektrální cytometrie přináší revoluční změnu na poli průtokové cytometrie, a to tím, že na místo několika předdefinovaných vlnových délek (jeden detektor na jednu barvu) detekuje celé emisní spektrum vzorku. Výsledkem je větší počet měřitelných markerů (v současnosti až 20 při použití pouhých 3 excitačních laserů), výrazně větší flexibilita experimentálního designu, ale také větší přesnost měření při zachování možnosti použití všech reagencií a postupů dostupných v tradiční cytometrii. Tyto vlastnosti jsou nezbytné zejména v diagnostice imunitních dysregulací, kde je narušená „souhra“ buněk imunitního systému. Hyperspektrální cytometrie doplňuje již pořízený přístroj využívající principů hmotnostní cytometrie o možnost flexibilnějšího návrhu experimentů.

Vzhledem k tomu, že CLIP, laboratoř působící v rámci UK 2. LF a FN v Motole, je dnes superkonziliárním centrem pro pacienty s imunitními dysregulacemi, bude mít zpřesnění diagnostiky na tomto pracovišti pozitivní vliv na zdravotní péči v ČR.

Projekt je spolufinancován z Operačního programu Praha – Konkurenceschopnost.

http://www.oppk.cz

 

Cíle projektu

 

Hlavním cílem projektu „CLIP: Hyperspektrální cytometrie"je vytvořit špičkové pracoviště buněčné cytometrické analýzy, vybavené revoluční a moderní technologií v jedinečném kontextu integrované výzkumně - diagnostické laboratoře. Nová technologie umožní hlubší pochopení buněčných jevů (např. při vzniku autoimunity) v jejich plném kontextu. Umožní rozvoj relativně nové disciplíny Biologie systémů - “Systems Biology”.

 Realizace projektu umožní v konečném důsledku vyřešit významné výzkumné úkoly, např. popsat vývoj krvetvorných buněk v kostní dřeni, kompartmentalizaci lymfocytů v periferní krvi nebo poruchy vývoje lymfocytů Hlavním cílem projektu „CLIP Leukémie: buněčná analýza hmotnostní cytometrií“ je prostřednictvím unikátní technologie mass cytometry doplnit možnosti a kapacity buněčné analýzy v laboratořích CLIP, což povede k těmto dílčím cílům:

Řešení výzkumných otázek

- umožní popsat vývoj krvetvorných buněk v kostní dřeni, včetně spuštěných signálních drah

- umožní popsat kompartmentalizaci lymfocytů v periferní krvi

- umožní systémově (ve vzájemných vztazích) popsat změny lymfocytů v průběhu specifické imunitní reakce

- umožní popsat poruchy vývoje lymfocytů při funkční imunodeficienci (primární i sekundární)

Přispění k diagnostice imunitních dysregulací, zejména u dětských pacientů:

- diagnostický algoritmus primárních imunodeficiencí, kde hyperspektrální cytometrie slouží jako první diagnostický krok a zároveň navrhuje následná vyšetření genetická, funkční vyšetření a vyšetření hmotnostním cytometrem

- proteinová a buněčná diagnostika imunodeficience

- umožní zavedení nových testů pro autoimunitní choroby

- přímo či nepřímo ovlivní diagnostiku v hematologii a imunologii ve všech pražských fakultních nemocnicích

Vyšší atraktivita, konkurenceschopnost a výkon CLIPu ve výzkumu, inovacích a vývoji nových nástrojů

- umožní doktorandům práci s nejmodernější analytickou instrumentací

- zvýší atraktivitu pro zahraniční spolupráce, doktorandy i vědce - seniory

Přispění ke zlepšení zdravotní situace v regionu

- bude stimulovat zapojení mezinárodních biotechnologických a farmaceutických firem do klinických studií rezistentních onemocnění s vysokou smrtností v Praze, což povede k přímému zlepšení výsledků zdravotní péče v regionu

- zvýší se konkurenceschopnost pražských pracovišť získávat zahraniční granty

- přispěje k přenosu moderních technologií do diagnostiky a lékařské péče v Praze

Uplatnění inovativních technologií ve výzkumu ČR

- podpoří technologií stimulovaný rozvoj bioinformatiky

- podpoří implementaci bioinformatických nástrojů do biologie i diagnostiky

 

Vybavení a metody

 

Během poslední dekády molekulárně biologické metody (zejména detekce fůzních genů a onkogenů založená na polymerázové řetězové reakci) umožnily nový vhled do klasifikace dětských leukemií a sledování průběhu léčby. Tyto metody jsou však časově náročné, nelze je aplikovat na všechny skupiny pacientů a neumožňují přímé zaměření na konkrétní buněčné pod-populace.

Průtoková cytometrie se stala klíčovým nástrojem pro výzkum poruch krvetvorby zejména díky své schopnosti měřit současně několik markerů na jednotlivé buňce. Jak se porozumění problematice prohlubovalo, rostl i počet markerů, které je potřeba měřit. Kromě standardního určování fenotypu průtoková cytometrie přichází ke slovu při monitorování odpovědi na léčbu (měření změn na buňce v odpovědi na terapeutikum) nebo při výzkumu signalizačních drah. Dá se tedy očekávat, že v blízké době budou cytometrické testy rutinním postupem personalizované medicíny. Všechny tyto pokroky vedou k poptávce po větším počtu měřitelných signálů. Ačkoli jsou současné fluorescenční průtokové cytometry schopny měřit současně až 17 markerů, tento počet již nestačí potřebám. I když je možné rozdělit vzorek na několik částí a na každé analyzovat jinou množinu znaků, má toto řešení podstatná omezení - není možné získat celkový obraz všech znaků a vzhledem k tomu, že počet takových výběrů roste exponeciálně s počtem analyzovaných znaků, stává se rychle nepoužitelným (finanční i časová náročnost a množství materiálu (krve), který by bylo třeba analyzovat).

 

Hyperspektrální cytometrie

 

Hyperspektrální cytometrie detekuje celé emisní spektrum analyzovaného vzorku (tedy signál z více fluorochromů najednou) pomocí multi-anodového fotomultiplikátoru. Pro každou buňku tak vzniká spektrální otisk, který je dále analyzován. Tato myšlenka není nová, ale teprve současné pokroky ve vývoji vysoce citlivých fotomultiplikátorů umožnily vytvoření dostupného sytému.

Spektrální otisk jednotlivých buněk je poté rozložen (spectral unmixing) na signály jednotlivých molekul. Tato metodika umožnuje jednak výrazně větší počet měřených markerů (v současnosti až 20 s pouhými 3 lasery), ale přináší také výrazný pokrok v přesnosti - počet měřených oblastí emisního spektra je vždy větší než počet fluorochromů a rozklad signálu (spectral unmixing) je tak přeurčen. Je tedy možné spočíst autofluorescenci buněk nebo jakýkoli jiný signál nepocházející z použitých fluorochromů a provést příslušnou korekci. Tato technologie přináší také výrazně větší flexibilitu experimentálního designu (při zachování možnosti použití všech reagencií a postupů tradiční cytometrie), díky schopnosti odlišit signál s fluorochromů s podobným emisním spektrem, které by tradiční cytometrie odlišit nedokázala (což samozřejmě limitovalo jejich použití v experimentu)

Prezentovaná technologie umožňuje řešení otázek základního výzkumu a diagnostiky, které dosud nebylo možné metodicky uchopit. Kombinace množství měřitelných markerů, možnosti využití všech postupů tradiční cytometrie, rychlosti, vyšší flexibility experimentálního designu a větší přesnosti měření umožní lépe charakterizovat a pochopit funkci a vývoj imunitního systému a navrhnout přesnější a spolehlivější diagnostické postupy vedoucí k efektivnější péči o pacienty.

 Přístroj je vybaven softwarem, který transformuje hmotnostně spektrometrická data do standardního formátu průtokové cytometrie (FCS 3.0). To výrazně usnadňuje analýzu dat, pro kterou je tak možné použít některých ze standardních analytických platforem.

Pracoviště

 

http://clip.lf2.cuni.cz/cs/ a http://www.lf2.cuni.cz/info2lf/ustavy/kdo/

 

2. lékařská fakulta UK je opakovaně hodnocena jako jedna z nejlepších lékařských fakult a vykazuje nejlepší index vědecké produkce. Klinika dětské onkologie a hematologie (společné pracoviště 2. LF UK a FN Motol), jejíž součástí jsou laboratoře CLIP, patří k publikačně nejproduktivnějším součástem fakulty (http://clip.lf2.cuni.cz). Tým CLIP vedený prof. MUDr. Janem Trkou, Ph.D., je multioborový a sestaven je tak, aby zajistil náročné úkoly diagnostické i výzkumné, technologicky náročné metody a bioinformatické zpracování dat.

Laboratoř CLIP-cytometrie, vedená doc. MUDr. Ondřejem Hrušákem, Ph.D., je jednou ze dvou základních zaměření laboratoří CLIP, v současné době disponuje 6-ti průtokovými cytometry (z toho 4 mají 3-4 lasery a => 8 fluorescenčních parametrů), což laboratoř činí největším cytometrickým centrem v ČR (počtem instrumentů, počtem změřených vzorků, komplexitou dat i publikační aktivitou). Význam laboratoře je reflektován i zapojením do lokálních, českých i mezinárodních projektů, s vysokou publikační úspěšností a vývojem nových metod. Z pohledu cytometrie jako inovativní technologie je nejdůležitější zapojení v International Society for Advancement of Cytometry (ISAC; http://isac-net.org), kterou bylo T. Kalinovi uděleno uznání jako budoucímu leaderovi „ISAC Scholar“, a dále v České společnosti pro analytickou cytometrii (ČSAC; www.csac.cz), jíž je T. Kalina předsedou. Vývoj cytometrických diagnostických metod probíhá mj. ve spolupráci s EuroFlow (www.euroflow.org). Proteomické profilování vyvíjíme spolu s Univerzitou v Oslo. Bioinformatické a matematické zpracování dat a vývoj algoritmů je dílem K. Fišera a J. Stuchlého. Zapojení diagnostických postupů do nejúspěšnějšího světového protokolu pro léčbu dětských leukémií AEIOP-BFM je umožněno dlouhodobou prací v mezinárodní skupině BFM (www.bfm-international.org), kde je J. Trka předsedou prestižního výboru pro „Biologii a diagnostiku“. Členové CLIP jsou dále členy českých, evropských i amerických hematologických společností.

Klíčové kompetence, dokladující připravenost řešitele projektu:

 

1. špičková úroveň buněčné analýzy (mnohobarevná cytometrie)

 

2. propojení s klinickými a diagnostickými otázkami

 

3. zavedená bioinformatika

 

4. proteomika

 

5. zkušenost s vývojem monoklonálních protilátek a jejich konjugací (partner UMG)

 

6. mezinárodní spolupráce

 

7. zkušenost ve vědě a výzkumu, kompetitivnost na mezinárodní scéně

 

Partneři projektu

Projekt je spolufinancován z Operačního programu Praha – Konkurenceschopnost.

http://www.oppk.cz

 

Na projektu se bude podílet partner FNM, se kterým byla sepsána partnerská smlouva, která vychází z dlouhodobé úspěšné spolupráce.

http://www.fnmotol.cz/

 

Harmonogram projektu

Termín realizace: 1. 3. 2015 - 28. 2. 2016

 

Fotogalerie

Schéma přístroje Sony SP6800 spectral cell analyzer (převzato z Grégori et al. - Current topics in microbiology and immunology - 2014)

 

Kontakt

doc. MUDr. Tomáš Kalina, Ph.D.

Laboratorní centrum CLIP

Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5

tomas.kalina(zavináč)lfmotol.cuni.cz

tel.: (+420) 22443 6487