OPPK - CLIP Leukémie: buněčná analýza hmotnostní cytometrí

OPPK - CLIP Leukémie: buněčná analýza hmotnostní cytometrí

 

 

Reg.číslo: CZ.2.16/3.1.00/21540

 

 






Úvod

 

Hlavní náplní projektu „CLIP Leukémie: buněčná analýza hmotnostní cytometrií“   je vybavit v současnosti nejlepší laboratoř buněčné analýzy metodou cytometrie v ČR unikátní a novou technologií hmotnostní cytometrie (mass cytometry), která umožní hlubší pochopení buněčných jevů (např. při zvratu krevních buněk do malignity-leukemie) v jejich plném kontextu. Umožní rozvoj relativně nové disciplíny Biologie systémů (Systems Biology). Smyslem je tedy podpora výzkumné infrastruktury 2. LF UK, která je úzce propojena s diagnostikou ve FN Motol, a tím pádem s léčbou pacientů. Svými mezinárodními i národními aktivitami (spolupráce, přednášková i výuková činnost, vývoj výzkumných i diagnostických nástrojů) však laboratoř CLIP již v současnosti obohacuje nejen pražské, ale i mimopražské výzkumné i diagnostické laboratoře.

Ve výsledku bude laboratoř CLIP z 2. LF UK patřit k několika špičkovým laboratořím (nyní pouze 10 v Evropě), které disponují touto revoluční technologií. Zcela unikátně to však bude v kontextu integrované výzkumně-diagnostické laboratoře, což umožňuje účinnější translační výzkum a přenos základních poznatků do praxe.

Projekt je řešen ve spolupráci s Ústavem Molekulární Genetiky, AV ČR.

Projekt je spolufinancován z Operačního programu Praha – Konkurenceschopnost.

http://www.oppk.cz

 

Cíle projektu

 

Hlavním cílem projektu „CLIP Leukémie: buněčná analýza hmotnostní cytometrií“ je prostřednictvím unikátní technologie mass cytometry doplnit možnosti a kapacity buněčné analýzy v laboratořích CLIP, což povede k těmto dílčím cílům:

Řešení výzkumných otázek

- umožní popsat vývoj krvetvorných buněk v kostní dřeni, včetně spuštěných signálních drah

- umožní popsat aberantně a asynchronně exprimované povrchové znaky na leukemických protějšcích krevních buněk

- umožní popsat kompartmentalizaci lymfocytů v periferní krvi

- umožní systémově (ve vzájemných vztazích) popsat změny lymfocytů v průběhu specifické imunitní reakce

- umožní popsat poruchy vývoje lymfocytů při funkční imunodeficienci (primární i sekundární)

- umožní popsat fenotypové změny v myších modelech knock-out genů s ještě neznámou funkcí v imunitním systému a krvetvorbě

Vývoj nových diagnostických metod

-umožní vyvinout metodiku extrémně citlivé detekce Minimální reziduální nemoci (stanovení 1 leukemické buňky mezi 100 000 zdravých)

- proteinová a buněčná diagnostika imunodeficience - zavedení nových testů

- přímo či nepřímo ovlivní diagnostiku v hematologii a imunologii ve všech pražských fakultních nemocnicích

Vyšší atraktivita, konkurenceschopnost a výkon CLIPu ve výzkumu, inovacích a vývoji nových nástrojů

- umožní doktorandům práci s nejmodernější analytickou instrumentací

- zvýší atraktivitu pro zahraniční spolupráce, doktorandy i vědce - seniory

- zvýší konkurenceschopnost pražských pracovišť získávat zahraniční granty

- podpoří vstup do mezinárodních konsorcií

- bude stimulovat zapojení mezinárodních biotechnologických a farmaceutických firem do klinických studií rezistentních onemocnění s vysokou smrtností v Praze, což povede k přímému zlepšení výsledků zdravotní péče

Přenos technologií

- přispěje k přenosu moderních technologií do diagnostiky a lékařské péče v Praze

- podpoří technologií stimulovaný rozvoj bioinformatiky

- podpoří implementaci bioinformatických nástrojů do biologie i diagnostiky

 

Vybavení a metody

 

Během poslední dekády molekulárně biologické metody (zejména detekce fůzních genů a onkogenů založená na polymerázové řetězové reakci) umožnily nový vhled do klasifikace dětských leukemií a sledování průběhu léčby. Tyto metody jsou však časově náročné, nelze je aplikovat na všechny skupiny pacientů a neumožňují přímé zaměření na konkrétní buněčné pod-populace.

Průtoková cytometrie se stala klíčovým nástrojem pro výzkum poruch krvetvorby zejména díky své schopnosti měřit současně několik markerů na jednotlivé buňce. Jak se porozumění problematice prohlubovalo, rostl i počet markerů, které je potřeba měřit. Kromě standardního určování fenotypu průtoková cytometrie přichází ke slovu při monitorování odpovědi na léčbu (měření změn na buňce v odpovědi na terapeutikum) nebo při výzkumu signalizačních drah. Dá se tedy očekávat, že v blízké době budou cytometrické testy rutinním postupem personalizované medicíny. Všechny tyto pokroky vedou k poptávce po větším počtu měřitelných signálů. Ačkoli jsou současné fluorescenční průtokové cytometry schopny měřit současně až 17 markerů, tento počet již nestačí potřebám. I když je možné rozdělit vzorek na několik částí a na každé analyzovat jinou množinu znaků, má toto řešení podstatná omezení - není možné získat celkový obraz všech znaků a vzhledem k tomu, že počet takových výběrů roste exponeciálně s počtem analyzovaných znaků, stává se rychle nepoužitelným (finanční i časová náročnost a množství materiálu (krve), který by bylo třeba analyzovat).

 

Hmotnostní cytometr CyTOF

 

Tato omezení překonává nová metoda hmotnostní cytometrie, kde jsou monoklonální protilátky označeny izotopy těžkých prvků a výsledky analyzované na hmotnostním spektrometru (Bendall et al. 2011). Cytometr tak není limitován počtem laserů, resp. detektorů ani překryvem emisních spekter fluorescenčních značek používaných v klasické cytometrii a umožňuje měřit desítky markerů naráz (prakticky bylo použito 34 znaků, je možné počet zvýšit až na 100).

Tato nová technologie přináší nové výzvy zejména v oblasti interpretace dat a vývoje monoklonálních protilátek a jejich konjugace.

Hmotnostní spektrometrie je analytická metoda používaná ke stanovení elementárního složení vzorku, resp. hmotností částic. Princip metody spočívá v ionizaci analyzovaného vzorku a následném měření hmotností vzniklých iontů.

Přístroj využívá hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS, Inductively Coupled Plasma Mass Spectormetry), která je nejpokročilejší metodou analýzy složení prvků studovaného vzorku. Prvním krokem je velmi rychlé odpaření zmlženého vzorku pomocí vysokoteplotního plazmatu (7000 K). Odpaření přeruší všechny chemické vazby a vzniká tak směs jednotlivých atomů. Směs atomů je zároveň ionizována a převedena do prostředí vysokého vakua (10-5 Torru), kde dochází k detekci iontů. Ionty jsou vedeny tak, aby na detektor dopadaly v pořadí dle jejich hmotnosti. Tím je umožněno rozlišit a kvantifikovat jednotlivé typy iontů.

Spojením obou metod vzniká tzv. hmotnostní cytometrie. Použití přechodných prvků k značení protilátek eliminuje limitaci cytometrie způsobenou přesvitem fluorescenčních značek protilátek. Navíc tyto prvky se v biologických systémech prakticky nevyskytují (jsou pod detekční hranicí spektormetrie) odpadá tedy i problém autofluorescence a nespecifického pozadí.

 

Přístroj je vybaven softwarem, který transformuje hmotnostně spektrometrická data do standardního formátu průtokové cytometrie (FCS 3.0). To výrazně usnadňuje analýzu dat, pro kterou je tak možné použít některých ze standardních analytických platforem.

Reference:

1. Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, Amir ED, Krutzik PO, Finck R, et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 2011 May 6;332(6030):687–96. 

2. Newell EW, Sigal N, Bendall SC, Nolan GP, Davis MM. Cytometry by time-of-flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. Elsevier Inc.; 2012 Jan 27;36(1):142–52. 

3. Nolan GP. Flow cytometry in the post fluorescence era. Best Pract Res Clin Haematol. Elsevier Ltd; 2011 Dec;24(4):505–8.

4. Bodenmiller B, Zunder ER, Finck R, Chen TJ, Savig ES, Bruggner R V, et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat Biotechnol. Nature Publishing Group; 2012 Sep;30(9):858–67.

5. Amir el-AD, Davis KL, Tadmor MD, Simonds EF, Levine JH, Bendall SC, Shenfeld DK, Krishnaswamy S, Nolan GP, Pe'er D. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 2013 Jun;31(6):545-52.

 

Pracoviště

 

http://clip.lf2.cuni.cz/cs/ a http://www.lf2.cuni.cz/info2lf/ustavy/kdo/

 

2. lékařská fakulta UK je opakovaně hodnocena jako jedna z nejlepších lékařských fakult a vykazuje nejlepší index vědecké produkce. Klinika dětské onkologie a hematologie (společné pracoviště 2. LF UK a FN Motol), jejíž součástí jsou laboratoře CLIP, patří k publikačně nejproduktivnějším součástem fakulty (http://clip.lf2.cuni.cz). Tým CLIP vedený prof. MUDr. Janem Trkou, Ph.D., je multioborový a sestaven je tak, aby zajistil náročné úkoly diagnostické i výzkumné, technologicky náročné metody a bioinformatické zpracování dat.

Laboratoř CLIP-cytometrie, vedená doc. MUDr. Ondřejem Hrušákem, Ph.D., je jednou ze dvou základních zaměření laboratoří CLIP, v současné době disponuje 6-ti průtokovými cytometry (z toho 4 mají 3-4 lasery a => 8 fluorescenčních parametrů), což laboratoř činí největším cytometrickým centrem v ČR (počtem instrumentů, počtem změřených vzorků, komplexitou dat i publikační aktivitou). Význam laboratoře je reflektován i zapojením do lokálních, českých i mezinárodních projektů, s vysokou publikační úspěšností a vývojem nových metod. Z pohledu cytometrie  jako inovativní technologie je nejdůležitější zapojení v International Society for Advancement of Cytometry (ISAC; http://isac-net.org), kterou bylo T. Kalinovi uděleno uznání jako budoucímu leaderovi „ISAC Scholar“, a dále v České společnosti pro analytickou cytometrii (ČSAC; www.csac.cz), jíž je T. Kalina předsedou. Vývoj cytometrických diagnostických metod probíhá mj. ve spolupráci s EuroFlow (www.euroflow.org). Proteomické profilování vyvíjíme spolu s Univerzitou v Oslo. Bioinformatické a matematické zpracování dat a vývoj algoritmů je dílem K. Fišera a J. Stuchlého. Zapojení diagnostických postupů do nejúspěšnějšího světového protokolu pro léčbu dětských leukémií AEIOP-BFM je umožněno dlouhodobou prací v mezinárodní skupině BFM (www.bfm-international.org), kde je J. Trka předsedou prestižního výboru pro „Biologii a diagnostiku“. Členové CLIP jsou dále členy českých, evropských i amerických hematologických společností.

Klíčové kompetence, dokladující připravenost řešitele projektu:

 

1. špičková úroveň buněčné analýzy (mnohobarevná cytometrie)

 

2. propojení s klinickými a diagnostickými otázkami

 

3. zavedená bioinformatika

 

4. proteomika

 

5. zkušenost s vývojem monoklonálních protilátek a jejich konjugací (partner UMG)

 

6. mezinárodní spolupráce

 

7. zkušenost ve vědě a výzkumu, kompetitivnost na mezinárodní scéně

 

Partneři projektu

Projekt je spolufinancován z Operačního programu Praha – Konkurenceschopnost.

http://www.oppk.cz

 

V rámci ČR laboratoř CLIP opakovaně projektově spolupracuje s Laboratoří molekulární imunologie Ústavu molekulární genetiky AV ČR, v.v.i., což vedlo i k partnerství na předkládaném projektu.  Partner se bude zejména účastnit interních hodnocení výstupů projektu, zajišťovat provozní materiál a aktivně se účastnit výzkumných projektů centra.

Konkrétně bude spolupracovat na výzkumu buněčné signalizace imunitních buněk, přípravě lanthanoidů značených monoklonálních protilátek a bude poskytovat zprávy o aktivitách souvisejících s projektem.

http://www.img.cas.cz/

 

Harmonogram projektu

Termín realizace: 1. 3. 2014 - 28. 2. 2015

 

Fotogalerie

 

Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, Amir ED, Krutzik PO, Finck R, et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 2011 May 6;332(6030):687–96.

 

Otevření laboratoře hmotnostní cytometrie

 

Další informace na stránkách LF2 UK

 

Kontakt

doc. MUDr. Tomáš Kalina, Ph.D.

Laboratorní centrum CLIP

Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5

tomas.kalina(zavináč)lfmotol.cuni.cz

tel.: (+420) 22443 6487